+7 (473) 207-24-00

Департамент здравоохранения Воронежской области

БУЗ ВО «Воронежская областная клиническая больница №1»

 

Автоматизация и стандартизация окраски

 мазков крови в практической деятельности

клинико-диагностических лабораторий

 

   Информационное письмо для врачей, биологов, фельдшеров-

 лаборантов клинико-диагностических лабораторий

  Составила:

   Зав. клинической лабораторией

  БУЗ ВО «ВОКБ №1»

   Назаренко В.Н.

 

 

 

 Воронеж 2015

 

 

       Общий анализ крови с подсчетом лейкоцитарной формулы и оценкой морфологии клеток является одним из самых распространенных исследований, выполняемых практически всем амбулаторным и стационарным пациентам независимо от диагноза. В клинико-диагностических лабораториях (КДЛ) для оценки морфологии клеток чаще всего используется микроскопия окрашенного мазка крови, которая до сих пор остается «золотым стандартом» при анализе клеток крови.

      Современной тенденцией развития гематологических исследований является внедрение систем автоматического распознавания изображений и компьютерной оценки морфологии элементов крови.

Примером практического использования таких систем являются различные приборы, выпускаемые компанией «West Vedica» (Австрия»: Visioh Hema Assist,Vision Hema Pro, Vision Hema Ultimate. Эти приборы самостоятельно отбирают изображения, с высокой точностью распознают тип клеток, сортируют и представляют их на экране компьютера в виде галерей изображений для последующего визуального контроля сотрудником лаборатории. Применение таких приборов позволяет избавить врача от необходимости непосредственно просматривать препарат окрашенного мазка для поиска клеток. Основной задачей врача становится анализ морфологических особенностей клеток, представленных в галереях изображений. Однако внедрение таких компьютерных технологий диктует более высокие требования к качеству мазка крови и, особенно, к стандартизации его окраски.

     На рынке присутствует целый ряд приборов для окраски мазков крови, различающимся по своим эксплуатационным характеристикам. Однако в обычной практике КДЛ преимущественно применяется ручной (неавтоматизированный) способ окраски мазков крови, с использованием различных штативов для более компактного расположения стекол, при этом не всегда удается обеспечить высокое качество окраски мазков крови и добиться хорошей воспроизводимости результатов анализа.

      Авторами проведено исследование, целью которого являлась стандартизация процедуры окраски мазков крови с применением реактивов различных производителей.

    Адаптировалась наиболее часто применяющаяся методика окраски мазков крови по Романовскому-Гимзе. Данный вид окрашивания является одним из наиболее распространенным в гематологии. В качестве фиксатора используется раствор эозина метиленового синего в метиловом спирте (фиксатор Май-Грюнвальд). Он обеспечивает быструю и качественную фиксацию клеток крови и хорошо сохраняет специфическую зернистость базофилов. Использование для фиксации мазков крови более доступного и дешевого этилового спирта приводит к плохой фиксации специфической зернистости базофилов  и ее последующему растворению при окрашивании, в результате чего базофилы при микроскопии могут легко быть приняты за нейтрофилы. Последующее окрашивание выполняли водным раствором красителя Романовского-Гимзы. На качество окрашивания мазка значительное влияние оказывает рН раствора краски, поэтому водный раствор краски готовили на дистиллрованной воде с добавлением фосфатного буфера (рН 7,0+_ 0,1).

      Оценивались наборы, состоящие из фиксатора Май-Грюнвальда и красителя Гимзы, следующих отечественных производителей:

 - НПФ «Абрис+» (г. Санкт-Петербург);

 - ЭКОлаб (г. Электрогорск);

 - Минимед (г. Брянск).

     Предварительно использовали традиционный протокол окраски мазков крови, применяемый при ручном методе. Высушенные мазки крови помещали в штатив для стекол в количестве 25шт. (максимальная загрузка штатива) и окрашивали в контейнере с краской по следующей схеме:

- фиксация мазков в фиксаторе Май-Грюнвальд – 3 мин;

- промывка в сосуде с дистиллированной водой – 2 мин;

- окраска красителем Гимзы, приготовленным на дистиллированной воде со стабилизированным значением рН – 10 мин;

- промывка дистиллированной водой – 2 мин;

- досушивание на воздухе – 10-15 мин.

      Окрашенные по такому протоколу мазки крови характеризовались двумя недостатками:

- в ряде случаев имела место недостаточно четкая окраска ядер и зернистости в цитоплазме лейкоцитов, в связи, с чем они выглядели несколько бледнее;

- наличие преципитатов красителя на поверхности мазка.

     Такие же преципитаты краски могут обнаруживаться и при ручной окраске мазков крови, но выявляются значительно реже, т.к. после ручной окраски каждый из мазков промывается под струей проточной воды. Такая промывка механически смывает формирующиеся преципитаты краски и препятствует их закреплению на поверхности мазка крови.

     В литературе указывается, что водный раствор красителя Гимзы нестабилен, краситель быстро выпадает в осадок. Для увеличения стабильности свежеприготовленного рабочего раствора красителя предложено добавление 50мл/л диметилсульфоксида (ДМСО), что увеличивает стабильность раствора, по крайней мере, до 4 часов.

     Однако, с учетом существующих в России сложностей в приобретении химических реактивов, ДСМО был заменен на более доступное соединение, в качестве которого выбран 96* этиловый спирт.

     В результате серии исследований было установлено, что добавление к раствору красителя Гимзы 10% (по объему) 96* этилового спирта предотвращает выпадение в осадок преципитатов эозина и азура. В связи с этим были внесены изменения в рекомендуемый протокол окраски в автоматах для окрашивания мазков крови. В качестве дополнительного соединения, стабилизирующего рабочий раствор красителя Гимзы, добавлен этиловый спирт, время окраски увеличено до 15 мин.

      Перед окраской мазков в рабочие ванночки вносятся следующие растворы:

- фиксатор Май-Грюнвальд, который может использоваться неоднократно (до 10 раз, затем его нужно сменить, т.к. происходит обводнение: впитывается вода, содержащаяся в мазках крови);

- краситель Гимзы, который готовится непосредственно перед окраской мазков крови. Для приготовления, например, 250мл рабочего раствора краски необходимо:

- взять 25мл краски;

- добавить 25мл 96* этилового спирта;

- довести объем до 250мл дистиллированной водой с добавлением

  фосфатного буфера ( рН 7.0+-0,1).

       Высушенные мазки крови следует в вертикальном положении поместить в штатив для стекол и окрашивать по следующему протоколу:

- фиксация мазков в фиксаторе Май-Грюнвальда – 3 мин;

- промывка в емкости с дистиллированной водой- 2 мин;

- окраска в свежеприготовленном водном растворе красителя Гимзы, приготовленном на дистиллированной воде со стабилизированным значением рН – 15мин.

       В результате получаются качественные, однотипно окрашенные мазки крови без присутствия преципитатов красителя.

       Хорошие результаты достигнуты на фиксаторах и красках всех апробированных производителей.

     По нашим данным, добавление 10% этилового спирта к водному раствору красителя Гимзы замедляет выпадение осадка красителя и предупреждает его закрепление на поверхности мазка крови. Предложенный способ модификации традиционного протокола окраски мазков крови по Романовскому-Гимзе обеспечивает качественное окрашивание мазков крови ручным методом в штативах, независимо от производителя набора красок.

Список использованной литературы:

1. Безруков А.В. Сравнительные характеристики автоматов окраски мазков Hema Tec 2000 и ЭМКОСТЕЙНЕР – АВТО/ Лабораторная медицина 2011. №11. С. 87-90.

2. Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е.. Долгов В.В. Лабораторная гематология. М.Тверь: ООО « Издательство « Триада» , 2006.226 с.

3. медицинские лабораторные технологии. Т.1 / Под ред. Проф. А.И. Карпищенко. СПб:  «Интермедика», 2002. 408с